Процессинг биология. Новосинтезированные рнк еще неактивны. Функциональная роль цепей ДНК
Это совокупность процессов обеспечивающих превращение синтезированной РНК (РНК-транскрипта) в функционально активные РНК (зрелые РНК), которые могут быть использованы при синтезе белков. Сами РНК-транскрипты функционально не активные. Процесс характерен для эукариот.
В результате процессинга изменяется структура и химическая организация РНК. РНК-транскрипт до образования зрелой РНК носит название про-иРНК (или в зависимости от вида РНК – про-тРНК, про-рРНК), т.е. предшественница РНК. Практически все РНК-транскрипты эукариот и прокариот(за исключением иРНК прокариот) подвергаются процессингу. Превращение РНК-транскрипта в зрелую РНК начинается в ядре, когда синтез РНК ещё не закончен и она не отделилась от ДНК. В зависимости от механизмов различают несколько этапов созревания РНК.
Взаимодействие про-иРНК с белком.
Метилирование про-иРНК.
Кэпирование 5’-конца.
Полиаденилирование.
Сплайсинг.
Графическая последовательность этапов изображена на рисунке 58. Следует отметить, что в живых организмах все вышеперечисленные процессы идут параллельно друг другу.
а. Взаимодействие про-иРНК с белком.
У бактерий ещё до окончания транскрипции 5 ’ конец транскрипта сразу же соединяется с рибосомой и иРНК включается в трансляцию. Поэтому, для бактериальной иРНК практически никакая модификация не требуется. У эукариот, синтезированный транскрипт выходит из ядра, попадает в цитоплазму и там соединиться с рибосомой. На своём пути он должен быть ограждён от случайных встреч с сильными реагентами и, в тоже время быть, доступен ферментам процессинга. Поэтому РНК-транскрипт сразу же по мере удлинения взаимодействует с белком. Здесь уместна аналогия – РНК-транскрипт располагается на белке как на операционном столе, он фиксируется химическими связями, одновременно в нём становятся доступными места модификации. РНК, связанная с белком, носит название рибонуклеопротеид (информосома). В такой форме транскрипт находится в ядре. При выходе из ядра одни РНК продолжают оставаться в соединении с белком, другие выходят из комплекса и принимают участие в трансляции.
б. Метилирование про-иРНК.
Чаще всего происходит у бактерий, у которых имеется специальный аппарат защиты от чужеродной
ДНК (вирусной, фаговой). Этот аппарат состоит из целого ряда ферментов разрезающих чужеродную ДНК или РНК в определённых сайтах в которой находится специфическая последовательность нуклеотидов. Ферменты носят название – рестриктазы . Понятно, что собственный, только что синтезированный РНК-транскрипт, также может быть подвергнут атаке рестриктаз. Чтобы это не случилось специальные ферменты, называемые метилазы, метилируют собственный РНК-транскрипт в тех сайтах, которые могут быть разрезаны собственными ферментами. У эукариот РНК-транскрипт метилируется в меньшей степени.
Промотор
Терминатор
Транскрипция
Про-иРНК фикси- Белок
рванная на белке
Метилирование про-иРНК
Кэпирование про-иРНК
Рис. 58. Схема основных моментов процессинга.
в. Кэпирование 5’конца.
Заключается в химическом и конформационном изменении
5’конца синтезированной РНК. Кэпирование происходит в момент синтеза РНК, ещё до её отделения. Процесс заключается в присоединении к свободному концу про-РНК специальных химических веществ, которые изменяют конформацию концевого участка. Кэпирование необходимо для инициации процесса трансляции.
Специальные ферменты присоединяют к 5’концу про-иРНК ГДФ (гуанозиндифосфат), а затем метилируют его.
5’ про-иРНК
СН 3
КЭП = ГДФ + СН 3
Рис.59. Структура КЭПа на 5’конце пре-иРНК эукариот.
Функции КЭПа.
Инициирует синтез белка.
Предохраняет про-иРНК от распада.
Участвует в удалении интронов.
г. Полиаденилирование.
Это процесс присоединения к 3’ концу про-иРНК 100 – 200 остатков адениловой кислоты. Эти остатки носят название поли-А последовательности (поли-А хвосты). Полиаденилированию подвергаются не все про-иРНК. Например, молекулы всех типов гистонов не содержат поли-А последовательности. Полиаденилирование предохраняет иРНК от разрушения.
На растущей цепи и-РНК имеется специальная последовательность нуклеотидов (ААУААА). Особый фермент (полиА-полимераза) находит это сочетание нуклеотидов, разрезает про-иРНК в этом месте и формирует полиадениловый хвостик.
Значение поли –А последовательностей:
Облегчают выход иРНК из ядра в цитоплазму.
Предохраняют иРНК от разрушения.
Недавно было выявлено ещё одно интересное свойство поли-А последовательностей – они участвуют в терминации синтеза про-иРНК. РНК-полимераза, формируя последовательность ААУААА в про-иРНК, получает сигнал о завершении синтеза РНК-транскрипта. Но синтез сразу не прекращается. Полная остановка его наступает после того, как РНК-полимераза встречает на матричной нити ДНК специфическую последовательность нуклеотидов (у разных генов она разная), которая и даёт окончательный сигнал о прекращении синтеза РНК.
ГТФ ПолиА - последовательность
рАрАрАрАрАрАрАрА-ОН
СН 3
КЭП = ГТФ + СН 3
Рис. 60. Структура КЭПа на 5’конце про-иРНК эукариот и полиадениловая последовательность на 3’конце про -иРНК.
д. Сплайсинг.
В РНК-транскрипте содержится определённое количество нуклеотидных последовательностей, которые были необходимы для успешного завершения трансляции и последующей модификации транскрипта (кэпирования, полиаденилирования и т.д.). Для выполнения основной роли РНК в цитоплазме – трансляции, эти последовательности не только не будут иметь функционального значения, но могут помешать нормальному течению синтеза белка. Поэтому в клетке предусмотрен механизм освобождения первичного транскрипта от целого ряда последовательностей, не имеющих решающего значения в трансляции.
К таким последовательностям прежде всего относят интроны.
Ген, с которого транскрибировалась про-иРНК содержит кодирующие и некодирующие последовательности. Кодирующие последовательности гена определяют аминокислоту и их последовательность в белке. Не кодирующие последовательности таким свойством не обладают. Кодирующие и некодирующие последовательности в гене чередуются, и их количество зависит от индивидуальных генов. В первичном транскрипте также содержатся кодирующие и некодирующие последовательности. Такая организация генов и про-РНК характерна для эукариот. Некодирующие последовательности про-иРНК носят название интроны , а кодирующие –экзоны. Длина интронов может быть от 50 до 12000 нуклеотидов. Ген начинается и
кончается экзоном. Прерывистое строение гена характерно для большинства эукариот. Интроны могут содержать все виды РНК – иРНК, тРНК, рРНК.
Вся совокупность экзонов (кодирующих белки) в геноме человека занимают всего 1,1 – 1,4 %. Средний ген человека содержит 9 интронов. По мере упрощения
организации организмов совокупная величина их экзонов возрастает (например у бактерий она равна 86%).
В вырезании интронов из РНК-транскрипта и сшивании оставшихся экзонов, принимает участие многокомпонентный комплекс. Основными его составляющими являются малые ядерные РНК (мяРНК) и белки-ферменты.
В целом комплекс носит название малые ядерные рибонуклеопротеиды, мяРНП или сплайосома . Сам процесс достаточно сложен и состоит из нескольких этапов (см. рис. 58).
1. Формирование сплайосомы . К началу и концу интрона прикрепляются фрагменты белка и мяРНК (рис. 56, Д) формируя сплайосому. (рис. 56, Д) Прикрепление комплекса мяРНП (рис. 56, Е).
Экзон 1 Интрон
Экзон 2
Петля
интрона вырезана
Рис. 61. Схема сплайсинга (объяснение в тексте).
Сближение соседних экзонов, за счёт образования петли интрона. Разрезание на границе экзон-интрон и соединение соседних (первого и второго) экзонов(рис. 56, В).
Удаление и разрушение петли и сплайосоме (рис. 56, Г, Ж).
Необходимо отметить, что при повреждении (мутации) интрона сплайсинг может быть не закончен, интрон не вырезан и конченый продукт – иРНК будет нести несвойственные ей последовательности нуклеотидов. Понятно, что это может привести к нарушению трансляции и выключению из метаболизма определённого белка
е. Альтернативный сплайсинг.
Такой тип сплайсинга происходит при экспрессии одного и того же гена в разных тканях.
Сущность его в том, что один и тот же участок гена в разных тканях может выступать в качестве интрона и экзона. Это приводит к образованию разных иРНК, которые кодируют белки с различной ферментативной активностью.
Так в клетках щитовидной железы синтезируется гормон кальцитонин. Он тормозит высвобождение кальция из костей. Ген, контролирующий синтез каль-
Ген, контролирующий кальцитонин
э и э и э и э и э и э
1 2 3 4 5 6
э и э и э и э и э и э
про-иРНК
1 2 3 4 5 6
В щитовидной железе В клетках головного мозга
иРНК
1 2 3 4 1 2 3 5 6
Кальцитонин Кальцитонинподобный белок
Рис.62. Альтернативный сплайсинг кальцитонина и кальцитонин-подобного белка.
цитонина, состоит из 6 экзонов, первичный транскрипт этого гена (про-иРНК) также состоит из 6 экзонов (рис. 62). Из первичного транскрипта формируется зрелая иРНК содержащая 4 экзона – 1,2,3,4. Экзоны № 5 и 6 были прочитаны как интроны и вырезаны. На основе такой и РНК синтезируется кальцитонин. В клетках головного мозга из первичного транскрипта, содержащего 6 экзонов, формируется зрелая иРНК, состоящая из 5 экзонов – 1,2,3,5,6. Четвёртый экзон был вырезан как интрон. Такая иРНК контролирует синтез кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие.
Другой ген Icarus (в названного в честь легендарного Икара) способен обеспечить за счёт альтернативного сплайсинга синтез 6 различных полипептидов. Кроме этого полипептиды образуют между собой в клетке около 20 различные ансамбли из одних и тех же полипептидов или различных.
Нарушение механизма сплайсинга может привести к патологическим состояниям, которые носят общее название талассемии . К ним относят заболевания связанные с частичным или полным подавление синтеза одной из цепей гемоглобин (α- или β-цепей). Например, болезни, связанные с недостатком синтеза β -цепи гемоглобина, могут возникнуть в результате мутаций в двух участка гена, кодирующего β-цепь – в сайте ответственном за полиаденилирование и в одном из интронов. В первом случае нарушается процесс формирования полиаденилового хвостика и формируется неполноценная β-цепь гемоглобина. Во втором случае сплайосома не способна вырезать повреждённый интрон и зрелая иРНК β-цепи гемоглобина не образуется. В любом случае нормальная функция эритроцитов будет существенно нарушена.
МЗ. Процессинг (или созревание РНК) это процесс превращения только что синтезированной, не активной РНК (про-иРНК) в функционально активную РНК. Процесс связан со структурными и химическими модификациями про-иРНК. Происходит в ядре до момента выхода РНК в цитоплазму. Состоит из нескольких этапов: присоединение про-иРНК к белку, метилирование некоторых оснований, маркировка одного из концов, полиаденилирование другого (противоположного) конца, вырезания интронов и сшивание экзонов. Последние два процесса носят название сплайсинг.
Вопросы к экзаменам.
1. Каким образом ферменты определяют большинство мест, где имеется повреждение молекулы ДНК?
ОТВЕТ. В месте повреждения молекулы ДНК в большинстве случаев наступает локальная денатурация. Её и определяют ферменты.
2. Что происходит в месте повреждения молекулы ДНК?
ОТВЕТ. В месте повреждения наступает локальная денатурация.
3. На основании чего ферменты репарации восстанавливают необходимую последовательность нуклеотидов в месте повреждения одной нити ДНК?
ОТВЕТ. На основании принципа комплементарности к нуклеотидам оппозитного участка нити ДНК.
4. На основании чего ДНК-полимераза правильно застраивает нуклеотидами бреши в повреждённой нити ДНК?
ОТВЕТ. На основании принципа комплементарности нуклеотидов застраиваемой цепи к нуклеотидам оппозитной нити.
5. Какой тип репарации осуществляется ферментом, который активируется фотоном?
ОТВЕТ. Фотореактивация.
6. Какой фермент осуществляет репарацию используя энергию солнца?
ОТВЕТ. Фотолиаза.
Какой фермент принимает непосредственное участие в синтезе молекуле РНК?
ОТВЕТ. ДНК-зависимая РНК-полимераза или РНК-полимераза.
Перечислите периоды транскрипции.
ОТВЕТ. Инициация, элонгация, терминация.
Из каких компонентов состоит инициаторный комплекс в процессе транскрипции?
ОТВЕТ. Из специального белка осевшего на промотор, РНК-полимеразы и транскрипционных факторов.
9. Как называется участок ДНК, где формируется инициаторный комплекс в процессе транскрипции?
ОТВЕТ. На промоторе.
10. Как называется последовательность нуклеотидов у прокариот, которую определяет специальный белок осаждающий на промоторе в период инициации транскрипции?
ОТВЕТ. Блок Прибнова.
11. Как называется последовательность нуклеотидов у эукариот, которую определяет специальный белок осаждающий на промоторе в период инициации транскрипции?
ОТВЕТ. ТАТА-бокс.
12. Где в молекуле ДНК располагается блок Прибнова у прокариот?
ОТВЕТ. На промоторе.
13. Где в молекуле ДНК располагается ТАТА-бокс у эукариот?
ОТВЕТ. На промоторе.
14. Как называется ферментативный комплекс, который формирует транскрипционный глазок?
ОТВЕТ. Инициаторный комплекс.
15. Как называется участок молекулы ДНК с которого начинается синтез РНК?
ОТВЕТ. Стартовой точкой, сайт начала транскрипции.
16. Назовите нуклеотиды, которые находятся в терминаторе и возможно участвуют в прекращении транскрипции.
ОТВЕТ. Г,Ц.
17. Назовите вторичную структуру в терминаторе, которая возможно участвует в прекращении транскрипции,
ОТВЕТ. Шпилька.
18. Как называются кодоны находящиеся в терминаторе и возможно участвующие в прекращении транскрипции.
ОТВЕТ. Бессмысленные (нонсенс) кодоны.
Процессинг - это созревание синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК. Проходит в ядре клетки у эукариот.
Составные части процессинга
- Удаление нуклеотидов. Результат: значительное уменшение длины и массы исходной РНК.
- Присоединение нуклеотидов. Результат: незначительное увеличение длины и массы исходной РНК.
- Модификация (видоизменение) нуклеотидов. Результат: появление в составе РНК редких "экзотических" минорных ("меньших") нуклеотидов.
Удаление нуклеотидов
1. Отщепление отдельных нуклеотидов по одному с концов цепи РНК. Осуществляется ферментами экзонуклеазами . Обычно преРНК начинается на 5"-конце АТФ или ГТФ, а на 3"-конце заканчивается участками ГЦ. Они нужны только для самой транскрипции, но не нужны для работы РНК, поэтому и отщепляются.
2. Отрезание фрагментов РНК, состоящих из нескольких нуклеоидов. Осуществляется ферментами эндонуклеазами . Таким способом с концов преРНК удаляются спейсерные последовательности нуклеотидов.
3. Разрезание преРНК на отдельные индивидуальные молекулы РНК. Осуществляется ферментами эндонуклеазами. Таким способом получаются рибосомальные РНК (рРНК) и гистоновые (мРНК).
4. Сплайсинг . Это вырезание срединных участков (интронных последовательностей) из преРНК и затем её сшивание . Вырезание осуществляется ферментами эндонуклеазами, а сшивание - лигазами . В результате получается мРНК, состоящая только из экзонных последовательностей нуклеотидов. Все пре-мРНК подвергаются сплайсингу, кроме гистоновых.
В результате удаления нуклеотидов в мРНК может, например, вместо 9200 нуклеотидов остаться всего 1200.
В среднем после процессинга в зрелой мРНК остаётся только 13% от длины пре-мРНК, а 87% теряется.
Присоединение нуклеотидов
К пре-мРНК с начального 5"-конца присоединяется с помощью нетипичной пирофосфатной связи модифицированный 7-метилгуаниловый нуклеотид, это компонент "колпачка" ("шапочки") мРНК. Этот колпачок создаётся ещё на начальном этапе синтеза РНК, для того чтобы защитить нарождающуюся РНК от нападок ферментов-экзонуклеаз, отщепляющих концевые нуклеотиды от РНК.
После завершения синтеза пре-мРНК к её конечному участку со стороны 3"-конца ферментом полиаденилатполимеразой последовательно приращиваются адениловые нуклеотиды, так что получается полиадениловый "хвост" из примерно 200-250 А-нуклеотидов. Мишенью для этого процесса служат последовательности ААУААА и ГГУУУГУУГГУУ в конце преРНК. В результате у преРНК отрезается её собственный хвостик и заменяется на полиА-хвост.
Видео: Снабжение преРНК шапочкой и хвостиком
У пре-тРНК хвост на её 3"-конце создаётся последовательным присоединением трёх нуклеотидов: Ц, Ц и А. Они образуют акцепторную ветвь транспортной РНК.
Модификация нуклеотидов
Важно отметить, что модифицированные минорные нуклеотиды появляются в созревающей РНК именнов в результате процессинга, а не встраиваются в РНК в процессе её синтеза на ДНК.
В нуклеотидах колпачка пре-мРНК происходит метилирование рибозы.
В пре-рРНК метилируются рибозные остатки выборочно по всей длине цепи, с частотой примерно 1%, т.е. 1 нуклеотид из 100.
В пре-тРНК модификация происходит наиболее разнообразно. Например, если уридин восстанавливается, то получается дигидроуридин, если изомеризуется, то получается псевдоуридин, если метилируется, то получается метилуридин, Аденозин может дезаминироваться, превращаясь в инозин, а если затем метилируется, то получается метилинозин. Происходят и другие модификации нуклеотидов.
Видео: Подробно о процессинге
Итог процессинга
Исходные преРНК укорачиваются и модифицируются . В ядре клетки появляются зрелые РНК разных видов: рРНК (28S, 18S, 5,8S, 5S), тРНК (по 1-3 вида для каждой из 20 аминокислот), мРНК (тысячи вариантов в зависимости от количества экспрессированных в данной клетке генов). Здесь же в ядре рРНК связываются с рибосомными белками и формируют большие и малые субъединицы рибосом. Они покидают ядро и выходят в цитоплазму. А мРНК связываются с транспортными белками и в таком виде выходят из ядра в цитоплазму.
Все стадии процессинга и-РНК происходят в РНП-частицах (рибонуклеопротеидных комплексах).
По мере синтеза про-и-РНК, она тут же образует комплексы с ядерными белками – информоферами . И в ядерные, и в цитоплазматические комплексы и-РНК с белками (информосомы ) входят s-РНК (малые РНК).
Таким образом, и-РНК не бывает свободной от белков, поэтому на всем пути следования до завершения трансляции и-РНК защищена от нуклеаз. Кроме того, белки придают ей необходимую конформацию.
Пока вновь синтезированная про-и-РНК (первичный транскрипт или гя-РНК – гетерогенная ядерная РНК) еще находится в ядре, она подвергается процессингу и превращается в зрелую и-РНК, прежде чем начать функционировать в цитоплазме. Гетерогенная ядерная РНК копирует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора, включая нетранслируемые области. После этого гя-РНК претерпевает преобразования, которые обеспечивают созревание функционирующей матрицы для синтеза полипептидной цепочки. Обычно гя-РНК в несколько раз (иногда в десятки раз) больше зрелой и-РНК. Если гя-РНК составляет примерно 10 % генома, то зрелая и-РНК – только 1-2 %.
В ходе ряда последовательных стадий процессинга из про-и-РНК (транскрипта) удаляются некоторые фрагменты, ненужные в последующих стадиях, и происходит редактирование нуклеотидных последовательностей.
При кэпировании происходит присоединение к 5"-концу транскрипта 7-метилгуанозина посредстом трифосфатного моста, соединяющего их в необычной позиции 5"-5", а также метилирование рибоз двух первых нуклеотидов. Процесс кэпирования начинается еще до окончания транскрипции молекулы про-и-РНК. По мере образования про-и-РНК (еще до 30-ого нуклеотида), к 5"-концу, несущему пуринтрифосфат, присоединяется гуанин, после чего происходит метилирование.
Функции кэп-группы:
ü регулирование экспорта и-РНК из ядра;
ü защита 5"-конца транскрипта от экзонуклеаз;
ü участие в инициации трансляции: узнавание молекулы и-РНК малыми субъединицами рибосомы и правильная установка и-РНК на рибосоме.
Полиаденилирование заключается в присоединении к 3"-концу транскрипта остатков адениловой кислоты, который осуществляет специальный фермент poly(A)-полимераза.
Когда синтез про-и-РНК завершен, то на расстоянии примерно 20 нуклеотидов в направлении к 3"-концу от последовательности 5"-AAУAA-3" происходит разрезание специфической эндонуклеазой и к новому 3"-концу присоединяется от 30 до 300 остатков АМФ (безматричный синтез).
Сплайсинг [англ. “splice” – соединять, сращивать]. После полиаденилирования про-и-РНК подвергается удалению интронов. Процесс катализируется сплайсосомами и называется сплайсингом. В 1978 г. Филипп Шарп (Массачусетский технологический институт) открыл явление сплайсинга РНК.
Сплайсинг показан для большинства и-РНК и некоторых т-РНК. У простейших найден автосплайсинг р-РНК. Сплайсинг показан даже для археобактерий.
Не существует единого механизма сплайсинга. Описано по крайней мере 5 разных механизмов: в ряде случаев сплайсинг осуществляют ферменты-матюразы, в некоторых случаях в процессе сплайсинга участвуют s-РНК. В случае автосплайсинга процесс происходит благодаря третичной структуре про-р-РНК.
Для и-РНК высших организмов существуют обязательные правила сплайсинга:
Правило 1 . 5" и 3" концы интрона очень консервативны: 5"(ГT-интрон-AГ)3" .
Правило 2 . При сшивании копий экзонов соблюдается порядок их расположения в гене, но некоторые из них могут быть выброшены.
Точность сплайсинга регулируют s-PНК: малые ядерные РНК (мя-РНК) , которые имеют участки, комплементарные концам интронов. мя-РНК комплементарна нуклеотидам на концах интронов – она временно соединяется с ними, стягивая интрон в петлю. Концы кодирующих фрагментов соединяются, после чего интрон благополучно удаляется из цепи.
③ ТРАНСЛЯЦИЯ [от лат. “translatio” – передача] заключается в синтезе полипептидной цепи в соответствии с информацией, закодированной в и-РНК. Молекула и-РНК (после процессинга у эукариот и без процессинга у прокариот) участвует в другом матричном процессе – трансляции (синтезе полипептида), который протекает на рибосомах (рис. 58).
Рибосомы – немембранные самые мелкие клеточные органоиды, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке Е. coli присутствует около 10 3 – 5x10 3 рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290Å. У эукариот – 220 х 320Å.
Выделяют четыре класса рибосом:
1. Прокариотические 70S.
2. Эукариотические 80S.
3. Рибосомы митохондрий (55S – у животных, 75S – у грибов).
4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).
S – коэффициент седиментации или константа Сведберга . Отражает скорость осаждения молекул или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного веса.
Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).
Сложность объясняется тем, что все элементы рибосом представлены в одном экземпляре, за исключением одного белка, присутствующего в 4 копиях в 50S субъединице, и не могут быть заменены.
р-РНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.
23S р-РНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S р-РНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона и-PHK, 5S р-РНК – для правильной ориентации аминоацил-тPHK на рибосоме.
Все р-РНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.
р-РНК в значительной степени метилированы (СН 3 -группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).
Порядок сборки субъединиц из р-РНК и белков строго определен. Субъединицы, не соединенные друг с другом, представляют собой диссоциированные рибосомы. Соединенные – ассоциированные рибосомы. Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg 2+ (до 2x10 3 ионов на рибосому). Магний нужен для компенсации отрицательного заряда р-РНК. Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg 2+ (в меньшей степени – марганца Мn 2+).
Молекулы т-РНК представляют собой относительно небольшие нуклеотидные последовательности (75-95 нуклеотидов), комплементарно соединённые в определённых участках. В результате формируется структура, напоминающая по форме лист клевера, в которой выделяют две наиболее важные зоны – акцепторная часть и антикодон.
Акцепторная часть т-РНК состоит из комплементарно соединённых 7 пар оснований и несколько более длинного одиночного участка, заканчивающегося 3′-концом, к которому присоединяется транспортируемая соответствующая аминокислота.
Другой важный участок т-РНК – антикодон , состоящий из трёх нуклеотидов. Этим антикодоном т-РНК по принципу комплементарности определяет себе место на и-РНК, определяя тем самым очерёдность присоединения транспортируемой им аминокислоты в полипептидную цепочку.
Наряду с функцией точного узнавания определённого кодона в и-РНК молекула т-РНК связывается и доставляет к месту синтеза белка определённую аминокислоту, присоединённую ферментом аминоацил-тРНК-синтетазы. Этот фермент обладает способностью к пространственному узнаванию, с одной стороны, антикодона т-РНК и, с другой, – соответствующей аминокислоты. Для транспортировки 20 типов аминокислот используются свои транспортные РНК.
Процесс взаимодействия и-РНК и т-РНК, обеспечивающий трансляцию информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот, осуществляется на рибосомах.
Рибосомы представляют собой сложные комплексы рибосомной РНК (р-РНК) и разнообразных белков. Рибосомная РНК является не только структурным компонентом рибосом, но и обеспечивает связывание её с определённой нуклеотидной последовательностью и-РНК, устанавливая начало и рамку считывания при образовании пептидной цепи. Кроме того, они обеспечивают взаимодействие рибосомы с т-РНК.
В рибосомах имеются две зоны. Одна из них удерживает растущую полипептидную цепь, другая – и-РНК. Кроме того, в рибосомах выделяют два участка, связывающих т-РНК. В аминоацильном участке размещается аминоацил-т-РНК, несущая определённую аминокислоту. В пептидильном находится т-РНК, которая освобождается от своей аминокислоты и покидает рибосому при её перемещении на один кодон и-РНК.
В процессе трансляции выделяют следующие стадии :
1. Стадия активации аминокислот . Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи особых ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаз) в присутствии АТФ. Для каждой аминокислоты существует свой фермент и своя т-РНК.
Активированная аминокислота присоединяется к своей т-РНК с образованием комплекса аминоацил-т-РНК (аа-т-РНК). Только активированные аминокислоты способны образовывать пептидные связи и формировать полипептидные цепочки.
2. Инициация . Начинается с присоединения лидирующего 5"-конца и-РНК с малой субъединицей диссоциированной рибосомы. Соединение происходит так, что стартовый кодон (всегда АУГ) оказывается в «недостроенном» Р-участке. Комплекс аа-т-РНК с помощью антикодона т-РНК (УАЦ) присоединяется к стартовому кодону и-РНК. Имеются многочисленные (особенно у эукариот) белки – факторы инициации .
У прокариот стартовый кодон кодирует N-формилметионж, а у эукариот – N-метионин. В дальнейшем эти аминокислоты вырезаются ферментами и не входят в состав белка. После образования инициирующего комплекса происходит объединение субъединиц и «достраивание» Р- и А-участков (рис.60).
3. Элонгация . Начинается с присоединения в А-участок и-РНК второго комплекса аа-т-РНК с антикодоном, комплементарным следующему кодону и-РНК. В рибосоме оказываются две аминокислоты, между которыми возникает пептидная связь. Первая т-РНК освобождается от аминокислоты и покидает рибосому. Рибосома перемещается вдоль нити и-РНК на один триплет (в направлении 5"→3"). 2-я аа-т-РНК перемещается в Р-участок, освобождая А-участок, который занимает следующая 3-я аа-т-РНК. Таким же образом присоединяются 4-я, 5-я и т. д. аминокислоты, принесенные своими т-РНК.
4. Терминация . Завершение синтеза полипептидной цепочки. Наступает тогда, когда рибосома дойдет до одного из терминирующих кодонов. Имеются особые белки (факторы терминации ), которые узнают эти участки.
На одной молекуле и-РНК может располагаться несколько рибосом (такое образование называется полисома), что позволяет осуществлять синтез нескольких полипептидных цепей одновременно
Процесс биосинтеза белка проходит с участием большего количества специфических биохимических взаимодействий. Он представляет собой фундаментальный процесс природы. Несмотря на чрезвычайную сложность (особенно в клетках эукариот), синтез одной молекулы белка длится всего 3-4 секунды.
Аминокислотная последовательность выстраивается при помощи транспортных РНК (т-РНК), которые образуют с аминокислотами комплексы - аминоацил-тРНК. Каждой аминокислоте соответствует своя т-РНК, имеющая соответствующий антикодон, «подходящий» к кодону и-РНК. Во время трансляции рибосома движется вдоль и-РНК, по мере этого наращивается полипептидная цепь. Биосинтез белка обеспечивается за счет энергии АТФ.
Готовая белковая молекула затем отщепляется от рибосомы и транспортируется в нужное место клетки, но для достижения своего активного состояния белкам требуется дополнительная посттрансляционная модификация.
Биосинтез белка происходит в два этапа. В первый этап входит транскрипция и процессинг РНК, второй этап включаеттрансляцию. Во время транскрипции фермент РНК-полимераза синтезирует молекулу РНК, комплементарную последовательности соответствующего гена (участка ДНК). Терминатор в последовательности нуклеотидов ДНК определяет, в какой момент транскрипция прекратится. В ходе ряда последовательных стадий процессинга из мРНК удаляются некоторые фрагменты, и редко происходит редактирование нуклеотидных последовательностей. После синтеза РНК на матрице ДНК происходит транспортировка молекул РНК в цитоплазму. В процессе трансляции информация, записанная в последовательности нуклеотидов, переводится в последовательность остатков аминокислот.
19.ДНК. Строение, свойства, кодовая система.
Под процессингом РНК понимают процесс ее созревания , который протекает в период и после ее транскрипции и предшествует процессу трансляции.
Процессинг разных типов РНК протекает по-разному. Однако у прокариот процессинга матичной РНК (мРНК) не происходит. Обычно процессинг РНК рассматривается на примере мРНК эукариот.
Как известно, РНК синтезируется на участке одной из цепей ДНК, и этот процесс называется транскрипцией. В школьном курсе обычно сразу за транскрипцией рассматривается процесс трансляции, при котором мРНК используется в качестве матрицы для синтеза белка. Однако между транскрипцией и трансляцией с РНК происходит ряд превращений, в результате которых она становится функционально активной. Эти модификации в совокупности называют процессингом. Некоторые его этапы протекают уже в момент транскрипции.
Рассмотрим процессинг матричной (информационной) РНК эукариот.
Кэпирование . Еще на этапе транскрипции к начальному (5") концу молекулы РНК через трифосфатный (три остатка фосфорной кислоты) мостик присоединяется молекула метилгуанозина, которая представляет собой метилированное азотистое основание гуанозин. Также у первых двух нуклеотидов мРНК метилируются остатки рибозы. Эти процессы называются кэпированием, образуется кэп (шапочка). Он защищает молекулу от ферментативного распада, участвует в других этапах процессинга, инициирует трансляцию.
Полиаденилирование . После завершения транскрипции к концу (3") РНК присоединяется множество адениновых нуклеотидов (от 100 до 250). Образуется полиадениловый конец - поли-А. Он также выполняет защитную функцию, предотвращая действие ферментов-разрушителей.
Сплайсинг . Молекула-предшественник мРНК (пре-мРНК) представляет собой копию участка ДНК (гена), включающего нетранслируемые области (находящиеся на концах) и чередующиеся интроны и экзоны. Интроны не участвуют в трансляции и должны быть удалены перед ней. Сплайсинг - это процесс разрезания мРНК, удаление интронов и сшивание между собой оставшихся экзонов.
В результате сплайсинга длина молекулы мРНК сокращается в разы. Процесс катализируется специальным комплексом - сплайсосомой , включающей малые ядерные РНК и белки-ферменты. Экзоны могут быть сшиты между собой разными способами (по-разному чередоваться, какие-то могут быть опущены). Данное явление называется альтернативным сплайсингом. В результат одна пре-мРНК может дать несколько разных мРНК, на которых будут синтезироваться разные белки.
Транспортные РНК (тРНК) также нередко претерпевают процессинг. Однако он у них другой, в основном связан с метилированием отдельных нуклеотидов. В результате тРНК принимает характерную для нее форму и становится активной (способной связываться с аминокислотами).
Процессинг рибосомальных РНК (рРНК) в основном сводится к разрезанию общего транскрипта (пре-рРНК), из частей которого образуют три разных молекулы рРНК (из четырех).
После процессинга зрелые молекулы мРНК, тРНК, сформированные субчастицы рибосом (содержащие рРНК) транспортируются из ядра в цитоплазму, где, выполняя каждая свою роль, обеспечивают процесс трансляции (синтез белка).
У прокариотических организмов первичные транскрипты -кодирующих генов начинают использоваться в качестве матриц белкового синтеза еще до полного завершения транскрипции. Транскрипция и трансляция у прокариот - это сопряженный процесс. Транскрипты прокариотических рРНК и тРНК имеют гораздо большую протяженность, чем соответствующие зрелые молекулы РНК. Так, многие тРНК-транскрипты содержат более одной молекулы тРНК. Таким образом, для прокариотических организмов процессинг первичных рРНК-и тРНК-транскриптов является необходимым этапом образования зрелых молекул.
Практически все первичные транскрипты РНК у эукариот подвергаются сложному процессингу в период между их синтезом и началом реализации ими соответствующей функции - в роли мРНК или в роли самостоятельных структурных факторов, таких, как или тРНК. Процессинг происходит в первую очередь в самом ядре. Процессинг включает кэпирование, реакции расщепления и лигировання, присоединение дополнительных концевых нуклеотидов и нуклеозидную модификацию. От 50 до 75% ядерной РНК млекопитающих, включая и 5-кэпированные цепи, не входит в дальнейшем в состав цитоплазматических мРНК. Эта величина внутриядерной потери РНК значительно выше, чем та, которую можно подсчитать, учитывая только удаление некодирующих областей транскриптов (см. ниже). Точная функция «избыточной» РНК ядра клеток млекопитающих остается пока неизвестной.
Благодаря развитию методов рестрикционного картирования и секвенирования молекул ДНК удалось установить, что во многих генах эукариот между экзонами (т. е. кодирующими фрагментами последовательности) располагаются протяженные участки ДНК, не несущие генетической информации, непосредственно транслируемой в аминокислотную последовательность белков (см. гл. 38). Такие промежуточные последовательности, или интроны, обнаруживаются в большинстве, но не во всех генах высших эукариот. Первичные транскрипты структурных генов включают и участки, соответствующие нитронам. В ходе процесса, называемого «сплайсинг», эти участки первичного транскрипта точно вырезаются, а соответствующие экзоны - сшиваются. Процесс протекает в ядре, затем сформировавшиеся молекулы мРНК выходят в цитоплазму, где и происходит их трансляция (рис. 39.9).
До сих пор неизвестны точные механизмы безошибочного вырезания интронов и сшивания экзонов, транспорта РНК в цитоплазму. Однако исследования последних лет дали много новой информации об этих процессах. Хотя последовательности нуклеотидов в интронах даже в пределах одного транскрипта очень гетерогенны, удается выявить консенсусную последовательность для каждого из двух участков соединения интронов с экзонами (сайтов сплайсинга) (рис. 39.10). Консенсусная последовательность сайтов сплайсинга на границе интрон-экзон не настолько
Рис. 39.9. Расположение кодирующих и некодирующих последовательностей (интронов) в структуре гена куриного овальбумина. На рисунке информационные сегменты, входящие в состав зрелой мРНК, пронумерованы и выделены черным цветом. Первичный транскрипт начинается левее L-экзона и заканчивается в З-нетранслируемой области за экзоном 7. В нижней части рисунка представлена структура зрелой мРНК; над ней указаны номера экзонов, а под ней - порядковые номера нуклеотидов, точка инициации трансляции и положение стоп-кодона.
уникальна, чтобы гарантировать ее строго специфическое расщепление исключительно за счет действия какой-либо специализированной эндонуклеазы. Присутствующая в значительных количествах малая ядерная РНК (РНК U1) содержит последовательность, комплементарную консенсусной последовательности сайта сплайсинга (рис. 39.11). Кроме того, установлено, что молекулы U1-PHK в эукариотическом ядре специфически связываются с определенными белковыми факторами. Такие РНК-белковые комплексы избирательно ассоциируются с 5- и 3-последовательностями сайтов сплайсинга в РНК. Антитела против U1-белкового комплекса ингибируют процесс вырезания интронов in vitro.
Интересно, что у пациентов с аутоиммунным заболеванием - системной красной волчанкой - обнаружены антитела против некоторых специфических U1-белковых комплексов. Как это связано непосредственно с самим заболеванием, пока неясно.
Недавно было установлено, что в процессе удаления интронов из молекул-предшественников мРНК образуется необычная петлеобразная структура. Оказалось, что 5-конец последовательности интрона соединяется Т-5-фосфодиэфирной связью с аденилатом, расположенным на расстоянии 28-37 нуклеотидов от его 3-конца. Этот процесс и соответствующие структуры схематически представлены на рис. 39.12.
Что касается загадки взаимоотношений и соответствующих зрелых то ее уже можно считать разгаданной. Гетерогенная ядерная РНК представляет собой первичные транскрипты плюс молекулы, находящиеся на ранних стадиях процессинга, которые после кэпирования, добавления poly А-хвоста и удаления интронов транспортируются в цитоплазму уже в форме зрелых
Процессинг является еще одной потенциальной точкой регуляции экспрессии генов. Так, была продемонстрирована возможность альтернативного сплайсинга для одного и того же первичного транскрипта. Например, мРНК а-амилазы из слюнных желез и из печени крысы отличаются друг от друга структурой 5-концевых участков последовательности. Остальные участки мРНК, включая кодирующую область и сайт полиаденилирования, - идентичны. Дальнейший анализ показал, что для присоединения к одному и тому же «телу» мРНК двух различных кэпированных лидирующих последовательностей
Рис. 39.11. Предполагаемый механизм идентификации сайта сплайсинга при удалении интронов из образует комплементарный комплекс с дистальным концом консенсусной последовательности сайта сплайсинга на З-конце экзона а. Другой конец взаимодействует с консенсусным сайтом сплайсинга экзона b. Структура, обозначенная линией точек, вырезается, и молекула сшивается по остаткам G (затемненный прямоугольник).
Рис. 39.12. Предполагаемый путь сплайсинга Расщепление в -сайте сопровождается образованием петли и последующим ее высвобождением за счет отщепления от экзона b. Интрон изображен линией, экзоны а и b - квадратами. Эти реакции происходят при участии объединенных в прочный комплекс, входящий в состав рибонуклеопротеиновой структуры, которая получила название «сплайсосома».
используются разные сайты сплайсинга. Другой пример альтернативного сплайсинга - образование молекул мРНК, кодирующих две тяжелые цепи иммуноглобулинов. Одна молекула мРНК кодирует мембраносвязанную тяжелую цепь, а другая - секретируемую тяжелую цепь (см. гл. 41). Таким образом, сплайсинг необходим для формирования зрелых молекул мРНК и, кроме того, может использоваться в качестве одного из механизмов дифференциальной экспрессии генов.
Как оказалось, по крайней мере одна из форм Р-талассемии, болезни, при которой заметно снижен уровень экспрессии одной из цепей гемоглобина, является результатом нуклеотидной замены на границе интрон-экзон, что препятствует удалению интрона и ведет к снижению или полному подавлению синтеза Р-цепи.
Матричные РНК (мРНК)
Как упоминалось выше, молекулы млекопитающих содержат «кэпирующую» структуру на 3"-конце и в большинстве случаев полиаденилатный «хвост» на 3"-конце. Кэпирующая структура добавляется к мРНК в ядре до переноса мРНК в цитоплазму. Структура polyA присоединяется к 3"-концу транскрипта либо в ядре, либо в цитоплазме. Вторичное метилирование молекулы мРНК, в том числе 2-гидроксильных групп и атомов N6 аденилатных
остатков, происходит после перехода молекулы РНК в цитоплазму. Этот процесс может протекать и в ядре и играть определенную роль при сплайсинге. -Кэпирующая структура, судя по всему, нужна для образования нуклеопротеинового комплекса, в свою очередь необходимого для осуществления сплайсинга. Кроме того, она может участвовать в транспорте и инициации трансляции
Функция полиаденилатного «хвоста» мРНК неизвестна. Во многих случаях присутствие или отсутствие poly А непосредственно не связано с транспортом в цитоплазму, поскольку не все полиаденилированные гетерогенные ядерные РНК выходят в цитоплазму и не все цитоплазматические полиаденилированы. В клетках млекопитающих в ходе процессов, протекающих в цитоплазме, по-лиаденилатные «хвосты» мРНК могут как удлиняться, так и укорачиваться.
Оборот роlуА - содержащих мРНК в культивируемых клетках млекопитающих - процесс первого порядка со значением близким к времени удвоения количества клеток в культуре. Кинетика деградации гистоновых не содержащих poly A-структур, является процессом нулевого порядка, для которого характерна зависимость распада от возраста со временем жизни около 6 часов. Пока неясно, связаны ли эти различия с наличием или отсутствием концевых роlуА-последовательностей или с какими-то иными структурными особенностями молекул мРНК этого класса.
Размер молекул цитоплазматических мРНК даже после удаления poly А-цепочки остается значительно большим (часто в 2-3 раза), чем требуется для кодирования соответствующего полипептида. Избыточные нетранслируемые области есть как на 5-, так и на З-концах транслируемого участка, причем, как правило, 3 -нетранслируемая область достигает большей длины. Точная функция этих последовательностей неизвестна, есть основания считать, что они участвуют в процессинге, транспорте, деградации и трансляции РНК.
Транспортные РНК (тРНК)
Молекулы как описано в гл. 37 и 40, выполняют функцию адапторных молекул при трансляции в белковые последовательности. Молекулы содержат много необычных («минорных») нуклеиновых оснований. Некоторые из них представляют собой метилированные производные обычных оснований, другие - содержат нетрадиционные гликозидные связи. Молекулы тРНК как про-, так и эукариот первоначально транскрибируются в виде больших предшественников, которые часто содержат более одной молекулы тРНК, подвергающихся нуклеолнтическому процессингу при действии рибонуклеаз особого класса. Кроме того, гены некоторых тРНК содержат единичный интрон длиной 10-40 нуклеотидов, расположенный непосредственно перед участком, соответствующим антико-доновому плечу. Поэтому процессинг первичных транскриптов многих тРНК-молекул должен включать этап удаления интронов и точного сплайсинга в кодон - узнающей области. Этот этап имеет критическое значение для выполнения тРНК функции адапторных молекул при синтезе белка. Нуклеолитический процессинг предшественников тРНК, по-видимому, направляется не собственно нуклеотидной последовательностью, а особой трехмерной структурой, которую могут формировать молекулы тРНК, и потому реализуется только для молекул, способных к сворачиванию в определенные функциональные структуры.
Дальнейшие модификации молекул тРНК включают алкилирование нуклеотидов и присоединение характерного CCA-триплета к З-концу молекулы. Этот триплет служит точкой присоединения соответствующей аминокислоты, направляемой данной молекулой тРНК в реакцию синтеза полипептида. Метилирование предшественников тРНК млекопитающих происходит, вероятно, в ядре, а расщепление и присоединение ССА-триплета - в цитоплазме, поскольку скорость оборота для концевой части тРНК оказывается выше, чем для молекулы в целом. Для присоединения аминокислоты к CCA-концу требуются определенные ферменты цитоплазмы клеток млекопитающих.
Рибосомные РНК (рРНК)
В клетках млекопитающих молекулы рибосомных РНК (двух основных и одной минорной) транскрибируются в составе большого общего первичного транскрипта (рис. 39.13). Процессинг этого транскрипта с образованием зрелых транспортируемых в цитоплазму, происходит в ядрышке, где собственно и локализованы сами гены рибосомных РНК. В каждой клетке присутствуют сотни копий этих генов. Транскрипционные единицы содержат последовательности расположенные друг за другом в направлении 5-3. Первичный транскрипт размером подвергается интенсивному метилированию непосредственно в ядрышке. В этом -предшественнике участок, соответствующий содержит 65 метилированных рибозных остатков и 5 метилированных нуклеиновых оснований. Метилирование идет только на участках, формирующих в дальнейшем зрелые молекулы рРНК. 458-предшественник подвергается нуклеолнтическому процессингу, однако сигналы процессинга заметно отличаются от соответствующих сигналов в Вероятно, и механизм процессинга также отличается от механизма нуклеолитического процессинга при созревании
Рис. 39.13. Схема формирования зрелых рибосомных РНК в ходе процессинга молекул РНК-предшественников. Конечный продукт обозначен черными прямоугольниками. (Reproduced, with permission from Perry R. P.: Processing of RNA Annu. Rev. Biochem. 1976, 45:605.)
Почти половина исходного первичного транскрипта (рис. 39.13) подвергается деградации. В ходе процессинга в ядрышках происходит дальнейшее метилирование, и там же связываясь с рибосомными белками, формирует большую -субъединицу рибосомы. Молекула также образуется в ядрышке и входит составной частью в большую рибосомную субъединицу. Молекула в комплексе с набором соответствующих полипептидов образует малую -субъединицу рибосомы.